免疫组化是一种运用免疫学原理进行的一种抗原抗体反应。那免疫组化的具有原理是什么呢?免疫组化的作用又有哪些呢?今天小编就来为大家一一介绍一下。想知道的朋友不妨就来看一下吧。

　　免疫组化原理

　　相信大家都知道，一种技术都尤其原理的，不是吗?那免疫组化的原理是什么呢?

　　根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。

　　免疫组化分类

　　1.免疫荧光细胞化学技术

　　将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量。

　　2.免疫酶细胞化学技术

　　是目前免疫组织化学研究中最常用的技术.基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。

　　3.免疫胶体金技术

　　就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究.由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究。

　　免疫组化作用

　　以上我们也是知道免疫组化的原理以及分类了，那免疫组化有什么作用呢?下面我们就一起来看一下。

　　标本

　　实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理切片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

　　其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察;还能长期存档，供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

　　抗体

　　免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

　　常用染色方法

　　根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。

　　免疫组化操作步骤

　　免疫组化的操作步骤有哪些呢?相信很多人都是不知道的，既然不知道，那下面我们就一起来看一下吧。

　　1.切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行。

　　2.缓冲液洗3min/2次。

　　3.为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在HydrogenPeroxideBlock中孵育10-15分钟。

　　4.缓冲液洗5min/2次。

　　5.滴加UltraVBlock，在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。

　　(注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5-10%正常羊血清，这一步可以省略。)

　　6.缓冲液洗5min/2次。

　　7.滴加一抗工作液37℃孵育1-2小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)。

　　8.缓冲液洗5min/2次。

　　9.滴加PrimaryAntibodyEnhancer(增强子)，在室温下孵育20分钟。

　　10.缓冲液洗5min/2次。

　　11.滴加HRPPolymer(酶标二抗)，在室温下孵育30分钟。

　　(注：HRPPolymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)

　　12.缓冲液洗5min/2次。

　　13.向1mlDABPlusSubstrate(或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen(或AECPlusChromogen)，混匀后滴加到切片上，孵育3-15分钟。(具体时间由染色深浅决定。)

　　14.自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

　　免疫组化注意事项

　　1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

　　2.在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：

　　(1)固相载体的选择

　　许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

　　(2)包被抗体(或抗原)的选择

　　将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。

　　(3)酶标记抗体工作浓度的选择

　　首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

　　(4)酶的底物及供氢体的选择

　　对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

　　结语：以上就是小编为大家介绍的有关于免疫组化的原理以及免疫组化的一些作用。相信大家看完之后对此也是有所了解了，也知道免疫组化有哪些注意事项了。因此，在进行免疫组化的时候，则需要注意这些事项哦。